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Journal of Zhejiang University SCIENCE B
ISSN 1673-1581(Print), 1862-1783(Online), Monthly
2016 Vol.17 No.6 P.413-492
Articles
Magnolol pretreatment attenuates heat stress-induced IEC-6 cell injury
Chen Mei, Sha-sha He, Peng Yin, Lei Xu, Ya-ran Shi, Xiao-hong Yu, An Lyu, Feng-hua Liu, Lin-shu Jiang
DOI: 10.1631/jzus.B1500261 Downloaded: 2508 Clicked: 4905 Cited: 2 Commented: 0(p.413-424) <Full Text><PPT> 2027
创新点：首次在大鼠小肠上皮细胞热应激模型中证明厚朴酚可明显降低细胞损伤程度，且此作用与细胞周期G1期相关。
方法：本试验采用大鼠小肠上皮细胞（IEC-6）为研究对象，将其分为五组：对照组（37 °C，5% CO2），热应激组（42 °C，3 h），热应激+厚朴酚低浓度组（5 µmol/L），热应激+厚朴酚中浓度组（10 µmol/L），热应激+厚朴酚高浓度组（20 µmol/L）。采用MTS法复制热应激模型及厚朴酚药物浓度筛选；采用流式细胞术检测热应激造成大鼠小肠上皮细胞细胞周期阻滞及不同浓度厚朴酚缓解细胞周期阻滞情况；利用电子显微镜观察热应激造成的细胞损伤情况；利用荧光电子显微镜观察EdU染色后，热应激对细胞增殖情况的影响及不同浓度厚朴酚的修复作用；采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术检测热应激对细胞周期基因表达影响及不同浓度厚朴酚对细胞周期基因调节作用，采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测热应激对细胞周期蛋白表达的影响及不同浓度厚朴酚对细胞周期蛋白修复作用。
结论：流式细胞术显示热应激造成IEC-6细胞周期阻滞在G1期（96.5%），而三种浓度厚朴酚均可以缓解细胞周期阻滞现象且呈剂量依赖性（5 µmol/L 88.8%，10 µmol/L 81.0%，20 µmol/L 73.5%）。热应激导致阻滞细胞分裂的G1期基因p21、p27和Rb显著上调（P<0.01），显示细胞周期阻滞，不同浓度厚朴酚下调这三个基因表达且呈剂量依赖性；促进细胞分裂的G1期基因E2F1、CDK4和cyclin D1表达显著下调（P<0.01），显示细胞周期阻滞不能正常增值，厚朴酚有效上调这三个基因表达水平。热应激导致G1期阻滞细胞分裂蛋白p21及p27上调显著（P<0.01），厚朴酚有效下调p21及p27蛋白表达，且在20 µmol/L浓度时效果最佳；而G1期促进细胞分裂蛋白pRb、E2F1、CDK4和cyclin D1（CCND1）在热应激下表达显著下调（P<0.01），厚朴酚具有一定上调以上四个蛋白的作用，且在20 µmol/L浓度时效果最佳。厚朴酚作为天然成分药物，通过缓解热应激造成的IEC-6细胞G1期细胞周期阻滞，具有缓解热应激造成的细胞损伤能力，有望作为预防畜禽热应激的饲料添加剂。
关键词组：细胞周期阻滞；细胞损伤；热应激；IEC-6；厚朴酚
Wei Xu, Qing Zhou, Yong Yao, Xing Li, Jiu-liang Zhang, Guan-hua Su, Ai-ping Deng
DOI: 10.1631/jzus.B1500213 Downloaded: 3401 Clicked: 6252 Cited: 4 Commented: 0(p.425-436) <Full Text><PPT> 2520
创新点：首次探究了蓝莓花青素对建立的LPS诱导体外炎症模型的营养干预作用，并初步探究了发挥抗炎机制的作用通路。
方法：将RAW 264.7细胞分为对照组（不作处理）和实验组（1 µg/ml LPS刺激建模）。实验组进一步分为3个不同浓度组：400 µg/ml GBBAEs组、800 µg/ml GBBAEs组和1200 µg/ml GBBAEs组。用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、干扰素γ（INF-γ）等炎症因子的释放量；用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）分析IL-1β、IL-6、TNF-α、环氧合酶-2（COX-2）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的炎症相关基因mRNA的表达水平；用蛋白质印迹法（Western blot法）测定相关炎症蛋白COX-2和NF-κBp65表达水平。
结论：试验结果表明，通过ELISA法测定GBBAEs可以显著性抑制NO、PGE2、IL-1β、IL-6、INF-γ等炎症因子的释放；RT-PCR分析阐明在LPS诱导的单核-巨噬细胞RAW 264.7中，GBBAEs可以显著性抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2及MCP-1的炎症相关基因mRNA的表达水平。此外，Western blot法进一步显示GBBAEs对相关炎症蛋白COX-2和NF-κBp65表达具有明显抑制作用，进一步证实GBBAEs通过NF-κB机制通路来发挥抗炎作用。
关键词组：园蓝花青素；抗炎；单核-巨噬细胞RAW 264.7细胞；环氧合酶-2（COX-2）；NF-κBp65
Myricetin protects against diet-induced obesity and ameliorates oxidative stress in C57BL/6 mice
Hong-ming Su, Li-na Feng, Xiao-dong Zheng, Wei Chen
DOI: 10.1631/jzus.B1600074 Downloaded: 2680 Clicked: 6023 Cited: 4 Commented: 0(p.437-446) <Full Text><PPT> 2216
创新点：首次在高脂膳食诱导的C57BL/6肥胖小鼠模型中证明杨梅素可明显减轻肥胖小鼠的体重，同时改善伴随肥胖的氧化应激和炎症。分子机理研究表明杨梅素通过下调脂代谢相关的转录因子（PPARγ、C/EBPα和SREBP-1c）mRNA的表达，从而发挥减肥功效。
方法：将C57BL/6小鼠分为正常膳食组（ND，n=12）和高脂膳食组（HFD，n=24），分别给予正常膳食和高脂膳食喂食2周。之后，高脂膳食组分为高脂膳食组（n=12）和杨梅素保护组（HFD+M，灌胃150 mg/(kg·d)的杨梅素，n=12），继续处理10周。分析小鼠常规生理指标（体重和脏器重量）、生化指标（血糖浓度、甘油三酯和总胆固醇含量）、氧化应激指标（谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（T-AOC））和炎症指标（肿瘤坏死因子α（TNF-α））等。苏木精-伊红染色法（H&E）和油红染色法分别观察脂肪组织和肝脏组织形态。实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析小鼠脂肪组织PPARγ、C/EBPα和SREBP-1c等基因的mRNA表达水平。
结论：与高脂膳食对照组相比，杨梅素处理可以显著减轻肥胖小鼠的体重。同时能显著降低肥胖小鼠血糖、甘油三酯和总胆固醇的含量。此外，杨梅素处理能缓解伴随肥胖的氧化应激（GPX活性、T-AOC和丙二醛（MDA））和炎症（TNF-α）。分子机理研究发现杨梅素通过下调脂肪细胞生成（PPARγ和C/EBPα）和脂质合成（SREBP-1c）密切相关的转录因子的mRNA表达。本研究结果将为杨梅素减肥产品的开发提供一定的理论依据。
关键词组：杨梅素；肥胖；脂肪生成；氧化应激
Apigenin-7-O-β-
Hong-yun Peng, Xue-hong Zhang, Jin-zhong Xu
DOI: 10.1631/jzus.B1500242 Downloaded: 2950 Clicked: 5411 Cited: 0 Commented: 0(p.447-454) <Full Text><PPT> 2103
创新点：结合使用大孔树脂、凝胶树脂、聚酰胺树脂多种色谱柱技术，从铜耐性植物海州香薷中提取分离纯度达98%的黄酮苷类化合物芹菜素糖苷。
方法：以铜耐性植物海州香薷为原料，用60%乙醇溶液浸提，提取液依次使用石油醚、乙酸乙酯、饱和正丁醇萃取。实验中，对饱和正丁醇萃取层，使用D101型大孔吸附树脂粗分离提取，Sephadex™ LH-20型凝胶筛分分离，并借助半制备液相和聚酰胺树脂分离纯化，得到芹菜素糖苷单体（图1）。利用紫外光谱、液相色谱–质谱联用、红外光谱、一维和二维核磁图谱，鉴定芹菜素糖苷结构（图2~5）。
结论：芹菜素糖苷是铜耐性植物海州香薷体内的天然产物，利用色谱技术可以从海州香薷植物体中分离出芹菜素糖苷单体。
关键词组：色谱分离；铜耐性植物；海州香薷；黄酮苷；结构解析
Feng-ying Yan, Wei Xia, Xiao-xu Zhang, Sha Chen, Xin-zheng Nie, Li-chun Qian
DOI: 10.1631/jzus.B1500317 Downloaded: 2527 Clicked: 4691 Cited: 1 Commented: 0(p.455-464) <Full Text><PPT> 1978
创新点：成功将At-Bgl分离纯化出来，并首次将分离纯化后的At-Bgl应用于水解大豆异黄酮糖苷。
方法：利用超滤、透析、阴离子交换柱层析和聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）等手段分离纯化土曲霉来源的β-葡萄糖苷酶（表1），并用解析电离串联飞行时间质谱技术（MALDI-TOF/TOF MS）鉴定蛋白条带。以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNPG）为底物进行酶学特性研究；以pNPG和纤维二糖为底物，进行酶动力学参数研究 （表2）；以胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟动物胃肠道酸性环境，进行酸耐受性研究。通过高效液相色谱（HPLC）检测At-Bgl对大豆异黄酮糖苷的水解效果（表3）。
结论：At-Bgl属糖苷水解酶第三家族（GH3），分子量约为120 kDa（图1），最适酶解条件为pH 5.0和65 °C，具有良好的热稳定性和pH稳定性（图2），且胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性强（图3）。At-Bgl可将大豆异黄酮糖苷高效转化为异黄酮苷元 （图4）。综上所述，At-Bgl在增强动物胃肠道对大豆异黄酮的水解方面具有重要应用价值。
关键词组：β-葡萄糖苷酶；土曲霉；酶学特性；水解；大豆异黄酮
Sovichea Lay, Hai-ning Yu, Bao-xiang Hu, Sheng-rong Shen
DOI: 10.1631/jzus.B1500225 Downloaded: 2577 Clicked: 4238 Cited: 0 Commented: 0(p.465-475) <Full Text><PPT> 1937
创新点：开发一种新的瘦肉精检测方法。
方法：用β-环糊精（ally-β-CD）和甲基丙烯酸（MAA）为功能单体制作分子印迹聚合物（MIP），以盐酸克伦特罗作为模板，用乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）作为交联剂。联合使用ally-β-CD和MAA作为二元功能单体，能合成高质量的盐酸克伦特罗模板。
结论：与丙烯腈制作的MIP（M-AN）和甲基丙烯酸甲酯制作的MIP（M-MMA）相比，MAA制作的MIP聚合物（M-MAA）被证明具有更好的选择性萃取能力，被用来进行分子印记固相萃取猪肝中残留物。研究结果发现，其回收率高（91.03%~96.76%），且相对标准偏差低（RSD≤4.45%）。因此，这种方法可以用于食品质量和安全的分析，具有简单、成本低廉的特点，能够快速检测猪肝中的瘦肉精残留量。
关键词组：分子印迹聚合物；分子印迹固相萃取；盐酸克仑特罗；β-环糊精
Di Chen, Xiao-xuan Xin, Hao-cheng Qian, Zhang-yin Yu, Li-rong Shen
DOI: 10.1631/jzus.B1500295 Downloaded: 2886 Clicked: 4453 Cited: 1 Commented: 0(p.476-483) <Full Text><PPT> 1983
创新点：首次验证MRJPs对多种人体细胞的促分裂效果，证实MRJPs可部分替代FBS培养人体细胞，并取得培养人体细胞的MRJPs与FBS和细胞因子的适合比例。
方法：鲜蜂王浆中分离得到的MRJPs溶液与FBS按不同比例（0/10、3/7、6/4和9/1）复配成复合血清，分别添加于无血清培养基中用于培养293T、HFL-I、231、HCT116和Changliver等5种人体细胞。以添加体积分数为10%的FBS的无血清培养基为对照，根据MTT法测定的吸光度和细胞形态比较分析结果，得到促进细胞分裂的MRJPs溶液与FBS最佳配合比例。然后在筛选出的最佳复合血清中添加不同的细胞因子，再通过同样的比较分析，得到适合的细胞因子组合。
结论：MRJPs对多种人体细胞具有促进分裂作用，可部分替代FBS培养人体细胞。MRJPs与FBS的最佳配比为：60% MRJPs溶液和40% FBS（复合血清）；该复合血清与细胞因子的最佳组合为：复合血清+表皮生长因子+胰岛素-转铁蛋白-硒。
关键词组：蜂王浆主蛋白；灭活胎牛血清；细胞培养基；替代品；分裂； 细胞因子
Zhen-huan Fang, Xia-ping Fu, Xue-ming He
DOI: 10.1631/jzus.B1500086 Downloaded: 2416 Clicked: 4065 Cited: 3 Commented: 0(p.484-492) <Full Text><PPT> 1840
创新点：开发基于单积分球的水果组织光传输特性自动检测系统，验证其可靠性并应用于水果组织的分析，并获得猕猴桃组织不同部位在632.8 nm的吸收和散射系数。
方法：利用所搭建的单积分球系统，获取三个不同部位（果肉、种子和种子基座）组织的全反射和全透射信息，测量各个组织切片的厚度及折射率。运用逆倍增算法计算得到各组织样本的吸收系数μa和约化散射系数μs’，并根据计算所得结果对猕猴桃不同组织的光传输特性进行比较分析。
结论：本实验结果测得猕猴桃不同部位组织的吸收系数和散射系数分别为0.031~0.308 mm−1和0.120~0.946 mm−1，并显示猕猴桃不同部位组织的吸收和散射特性具有显著差异。种子部位受随机分散的种子的影响较大，组织较均匀的果肉和种子基座部位结果证实散射系数大于吸收系数，符合生物组织高散射介质特性。这些结果说明了定量测定组织的光传输特性参数对深入研究光与水果组织相互作用的重要性。
关键词组：光学特性；积分球；逆倍增算法；猕猴桃