Journal of Zhejiang University

Current Issue: <JZUS-B>

Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology)

ISSNs 1673-1581 (Print); 1862-1783 (Online); CN 33-1356/Q; started in 2005,Monthly.

JZUS-B is an international "Biomedicine & Biotechnology" reviewed-Journal indexed by SCI-E, MEDLINE, PMC, BA, BIOSIS Previews, JST, ZR, CA, SA, AJ, ZM, CABI, CSA, etc., and supported by the National Natural Science Foundation of China. It mainly covers research in Biomedicine, Biochemistry and Biotechnology, etc.

Impact factor: 1.099 (2011), 1.108 (2012), 1.293 (2013), 1.278 (2014), 1.303 (2015), 1.676 (2016), 1.815 (2017), 1.879 (2018).

Journal of Zhejiang University SCIENCE B

ISSN 1673-1581(Print), 1862-1783(Online), Monthly

2016 Vol.17 No.2 P.83-168

<<< CONTENTS >>>

Review

Review: Strategies used for genetically modifying bacterial genome: site-directed mutagenesis, gene inactivation, and gene over-expression

Jian-zhong Xu, Wei-guo Zhang

DOI: 10.1631/jzus.B1500187 Downloaded: 3403 Clicked: 5315 Cited: 0 Commented: 0(p.83-99) <Full Text> <PPT> 2059

Chinese summary <828> 遗传改造细菌基因组的策略：基因定点突变、基因失活和基因过表达

概要：该综述较为全面地概述了当前针对大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌基因组遗传改造的各个方法的具体流程、应用范围、注意事项以及其新颖之处，比较了针对基因定点突变、基因失活和基因过表达的各个方法所存在的优缺点，同时简单地介绍了利用质粒介导基因过表达所存在的问题。此外，还介绍了四种引物设计软件，并简单分析了它们的应用范围。为拟计划开展分子生物学实验的新手对关于细菌基因组遗传改造方法做了可靠的介绍，同时也为已进行相关实验的实验员提供关于基因定点突变、基因失活和基因过表达的最新信息。

关键词组：大肠杆菌；谷氨酸棒杆菌；DNA操作方法；定点突变；基因失活；基因过表达

Articles

Tissue-specific expression, developmentally and spatially regulated alternative splicing, and protein subcellular localization of OsLpa rice

Hai-ping Lu, Wei-qin Pang, Wen-xu Li, Yuan-yuan Tan, Qing Wang, Hai-Jun Zhao, Qing-Yao Shu

DOI: 10.1631/jzus.B1500205 Downloaded: 2849 Clicked: 4530 Cited: 0 Commented: 0(p.100-109) <Full Text> <PPT> 2019

Chinese summary <28> 水稻低植酸基因OsLpa1可变剪接和表达的时空特征及编码蛋白的亚细胞定位

目的：揭示水稻低植酸基因OsLpa1的分子生物学特征，特别是深化对其可变剪切和表达的时空和组织特征，以及蛋白亚细胞定位的认识。
创新点：确定了OsLpa1存在的三种剪切方式，明确了三种转录本在不同组织和发育时期丰度的变化；揭示了OsLpa1表达的组织和时空差异，确定其在根、种子糊粉层细胞和花丝中高度表达；明确了三种转录本编码的蛋白均定位于亚叶绿体。
方法：通过培育OsLpa1启动子与β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）杂合基因的转基因植株，通过不同组织的GUS组织化学染色确定OsLpa1表达的组织特异性；通过设计特异性引物确定OsLpa1存在的转录方式，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）分析三种转录本在不同组织和发育时期的丰度；采用OsLpa1三种转录本与绿色荧光蛋白（GFP）基因构建杂合基因并在水稻原生质体中的瞬时表达，在共聚焦显微镜下观察蛋白的亚细胞定位。
结论：OsLpa1在根、茎、叶和花丝有强烈的表达。它存在三种可变剪切方式，产生的三种转录本存在明显的时空和组织差异，但其编码的蛋白均定位于叶绿体。

关键词组：OsLpa1；低植酸；表达模式；可变剪接；亚细胞定位

Developing antibodies from cholinesterase derived from prokaryotic expression and testing their feasibility for detecting immunogen content in Daphnia magna

Hong-cui Liu, Bing-qiang Yuan, Shao-nan Li

DOI: 10.1631/jzus.B1500008 Downloaded: 2906 Clicked: 4524 Cited: 0 Commented: 0(p.110-126) <Full Text> <PPT> 1836

Chinese summary <30> 大型溞胆碱酯酶蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和适用性研究

目的：原核表达并纯化大型溞胆碱酯酶（ChE），制备鼠抗大型溞ChE多克隆抗体，并对抗体的适用性进行研究。
创新点：首次通过原核表达获得了大型溞重组ChE蛋白，通过免疫小鼠获得了高效价、高特异性的多克隆抗体，通过样品检测证明了抗体的适用性。
方法：利用聚合酶链式反应（PCR）技术获得大型溞ChE基因编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pET-29a(+)，构建重组表达质粒pET-ChE，用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达；对表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和酶活性检测，并对蛋白进行纯化（图4）；使用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体（图5），用酶联免疫吸附分析法（ELISA）对处于三唑磷和低温胁迫下以及经反复冻融处理的大型溞体内的ChE含量变化进行检测（图7、表6和7)，以评价抗体的可适用性。
结论：获得了高纯度的ChE重组蛋白；免疫小鼠后，获得了特异性强、高效价的抗体；通过对处于三唑磷和低温胁迫下以及经过反复冻融处理的大型溞体内的ChE含量的检测，证明了抗体的适用性。

关键词组：大型溞；胆碱酯酶；聚合酶链式反应（PCR）；重组胆碱酯酶蛋白；酶联免疫吸附分析法（ELISA）

bmo-miR-0001 and bmo-miR-0015 down-regulate expression of Bombyx mori fibroin light chain gene in vitro

Chen Chen, Yang-yang Fan, Xin Wang, Fei Song, Tao Jiang, Ping Qian, Shun-Ming Tang, Xing-Jia Shen

DOI: 10.1631/jzus.B1500078 Downloaded: 2807 Clicked: 4588 Cited: 1 Commented: 0(p.127-135) <Full Text> <PPT> 2132

Chinese summary <28> 家蚕miR-0001和miR-0015体外下调BmFib-L基因的表达

目的：探究新发现的两个miRNA对家蚕丝素轻链基因BmFib-L的调控作用。
创新点：在家蚕后部丝腺中发现两个新的miRNA，并首次证明它们对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L有负调控作用。
方法：本实验通过生物信息学分析，从家蚕后部丝腺miRNA高通量测序获得的新miRNA中，筛选出两个可能对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L有调控作用的miRNA，即bmo-miR-0001和bmo-miR-0015。设计茎环引物，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法对家蚕5龄3 d头部、表皮、脂肪体、马氏管、精巢/卵巢、丝腺（前、中、后）、气管、中肠和血淋巴细胞等12个不同组织的bmo-miR-0001和bmo-miR-00015进行半定量表达分析。并采用双荧光报告基因检测系统进一步在细胞水平上验证bmo-miR-0001和bmo-miR-0015对BmFib-L表达的调控作用。
结论：本实验中RT-PCR结果显示，这两个新miRNA在家蚕后部丝腺中表达量最高（图4）。双荧光报告基因检测结果显示，报告基因荧光素酶活性明显低于阳性对照组（图7），转染bmo-miR-0001和bmo-miR-0015表达载体的细胞，报告基因和荧光素酶活性分别只及对照组60%和69%。t检验分析结果显示两个实验组与对照组之间差异都达到显著水平（P<0.05）。由此可见，bmo-miR-0001和bmo-miR-0015在体外对BmFib-L的表达具有显著的抑制作用。

关键词组：家蚕；miRNA；bmo-miR-0001；bmo-miR-0015；BmFib-L；功能验证

PGC-1α regulates the cell cycle through ATP and ROS in CH1 cells

Xu-feng Fu, Kun Yao, Xing Du, Yan Li, Xiu-yu Yang, Min Yu, Mei-zhang Li, Qing-hua Cui

DOI: 10.1631/jzus.B1500158 Downloaded: 3406 Clicked: 4752 Cited: 5 Commented: 0(p.136-146) <Full Text> <PPT> 2068

Chinese summary <30> PGC-1α在CH1细胞中通过ATP和ROS调控细胞周期

目的：探讨在CH1细胞中过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（PGC-1α）调控细胞周期时三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）的作用机制。
创新点：构建了稳定表达PGC-1α的CH1细胞株，并系统地研究了PGC-1α调控细胞周期是通过ATP和ROS调节CyclinD1和CyclinB1的行使功能。
方法：以慢病毒质粒pBABE为载体构建了PGC-1α稳定表达的CH1 PGC-1α细胞株（PGC-1α），同时转染空质粒pBABE作为对照（PB），结合RNA干扰CH1 PGC-1α中PGC-1α的过表达（Si），测定了ATP和ROS水平。用流式细胞术检测了细胞周期和免疫印迹检测了CyclinB1/D1的表达，并进一步分别用寡霉素抑制PGC-1α细胞中的ATP生成，用H₂O₂处理细胞以增加外源ROS水平。然后检测ATP和ROS改变后，对CyclinB1/D1表达及细胞周期的影响，以明确ATP和ROS是否参与PGC-1α对细胞周期的调控作用。
结论：本实验成功构建了稳定表达PGC-1α的细胞株（图1和图2a），与PB对照和RNA干扰PGC-1α比较，过表达PGC-1α具有升高ATP、降低ROS和促进细胞周期的作用（图3和图4）。进一步用寡霉素抑制ATP合成后发现CyclinD1明显下调（图5），而加入H₂O₂增加外源ROS后发现CyclinB1显著上调（图6）。通过本实验我们提出PGC-1α调控细胞周期是通过升高ATP水平抑制CyclinD1表达和降低ROS水平促进CyclinB1表达来实现。

关键词组：过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（PGC-1α）；线粒体；氧化磷酸化；细胞周期；CyclinD1；CyclinB1

Immunomodulatory effect of a formula developed from American ginseng and Chinese jujube extracts in mice

Zhuo-ping Yu, Dong-dong Xu, Lai-feng Lu, Xiao-dong Zheng, Wei Chen

DOI: 10.1631/jzus.B1500170 Downloaded: 2911 Clicked: 6122 Cited: 7 Commented: 0(p.147-157) <Full Text> <PPT> 2182

Chinese summary <25> 复方西洋参和红枣制剂对小鼠免疫功能影响的研究

目的：综合评价复方西洋参和红枣制剂对于小鼠非特异性免疫和特异性免疫的影响，为开发新产品奠定基础。
创新点：本文首次以西洋参提取物和红枣提取物为原料制成复方制剂，并通过动物实验发现该制剂具有增强免疫功能，为开发功能性食品提供新思路。
方法：将西洋参与红枣提取物按一定比例制备复方制剂，以1.3、2.6和5.2 g/kg为低、中和高剂量给健康ICR小鼠连续灌胃此复方制剂4周，对照组灌胃同等剂量的无菌水，最后通过测定免疫相关指标对该复方制剂的免疫调节功能进行综合评价。
结论：此款复方制剂可以显著提高小鼠的胸腺和脾脏指数（表1），同时低剂量组小鼠的血清溶血素水平显著高于对照组，高剂量组小鼠的脾淋巴细胞增值能力约是对照组的2.4倍，自然杀伤细胞的活性也得到显著增强，中剂量组小鼠的NK细胞活性与对照组相比提高了78.6%（图2）。另外，此复方制剂能有效提高小鼠组织（肝脏、脾脏和胸腺）和血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）的活性，同时降低丙二醛（MDA）的含量（图3~6）。综上所述，此复方西洋参和红枣制剂可有效提高健康ICR小鼠的非特异性和特异性免疫功能，而其抗氧化功能有可能是其免疫调节活性的作用机制之一。

关键词组：西洋参；红枣；免疫调节；抗氧化活性

Potential natural exposure of endangered red-crowned crane (Grus japonensis) to mycotoxins aflatoxin B₁, deoxynivalenol, zearalenone, T-2 toxin, and ochratoxin A

Da-wei Liu, Hong-yi Liu, Hai-bin Zhang, Ming-chang Cao, Yong Sun, Wen-da Wu, Chang-hu Lu

DOI: 10.1631/jzus.B1500211 Downloaded: 3030 Clicked: 4144 Cited: 0 Commented: 0(p.158-168) <Full Text> <PPT> 1814

Chinese summary <27> 盐城生物圈保护区越冬丹顶鹤受到真菌毒素威胁的研究

目的：调查在盐城生物圈保护区越冬的丹顶鹤食物是否受到真菌毒素污染以及评估丹顶鹤受到真菌毒素威胁的风险。
创新点：首次证明在盐城生物圈保护区越冬的丹顶鹤受到真菌毒素的威胁。
方法：2013年11月至2015年3月，两个越冬期内在盐城生物圈保护区采集丹顶鹤不同觅食生境内113份食物样品。使用高效液相色谱法对这些食物中毒素（黄曲霉毒素B₁（AFB₁）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、T-2毒素（T-2）和赭曲霉毒素A（OTA））含量进行检测。
结论：盐城生物圈保护区内丹顶鹤食物受到真菌毒素的污染，人工湿地尤其是稻田不适宜作为鸟类的觅食地。

关键词组：食物；真菌毒素；丹顶鹤；盐城生物圈保护区