目的:供体角膜短缺是一个全球性问题.现有的角膜替代物主要依赖于传统的组织工程制造方法,仅支持具有不可控曲率的平坦或弯曲膜的制备.我们提出构建具有设计几何特征的弯曲薄膜,以通过生物3D打印实现厚度及曲率半径可控的角膜替代物.
创新点:提出一种集成的3D角膜替代物打印系统,为3D角膜支架提供了一种新颖的制作方法;提出角膜光学特性与角膜支架几何特征的关系,并分析影响角膜光学功能的相关影响因素.根据扫描数据,采用该方法可以快速构建具有天然角膜几何形状和尺度的角膜支架.使用该方法可获得具有高细胞活力的载有细胞的复杂弯曲角膜状结构.该方法具有低制造成本和高重复性,是根据需要快速构建角膜预替代物的有效方法.
方法:通过建立角膜数学模型,研究维持角膜视功能和生理学的关键几何参数和其他主导因素;根据天然角膜的表面拓扑结构,通过计算机辅助设计对精确定制的人造角膜进行建模;通过集成数字光处理和挤出生物打印来制备用于角膜替代的曲面薄膜.
结论:由于结构可控性等优点,生物3D打印是制备具有几何结构可控人工生物合成角膜的有效工具,可以个性化构建具有天然角膜尺度的角膜替代物.

关键词组：生物3D打印;角膜替代物;光固化打印;挤出打印;结构控制

目的:探讨视网膜中全反式视黄醛(atRal)能否代谢生成全反式维甲酸(atRA),并比较两者对视网膜色素上皮细胞(RPE)的细胞毒性作用,以阐明atRA生成的意义.
创新点:建立atRA的超高效液相串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法,并证明atRA的生成是视网膜中atRal的重要解毒代谢通路.
方法:利用UPLC-MS/MS分别检测猪眼神经视网膜及RPE层中atRA的含量;利用ARPE-19细胞系模拟atRal在RPE中累积,用UPLC-MS/MS检测细胞内及培养基中atRA的含量,并用定量聚合酶链反应(qPCR)检测CYP26b1的表达;利用CCK8、DCFH-DA染色、qPCR、western blot等方法对比等浓度atRA和atRal在RPE细胞中所诱 导的细胞毒性、氧化应激、凋亡相关蛋白表达水平;用UPLC-MS/MS检测视网膜atRal清除障碍的ABCA4^−/−RDH8^−/−小鼠眼球中atRA及全反式视黄醇.
结论:明确atRA在正常视网膜中能够代谢产生;证明其形成有利于RPE细胞中累积的atRal迅速代谢消除;其自身诱导细胞氧化应激的能力显著低于atRal,因而能显著减弱后者的细胞毒性.

关键词组：全反式维甲酸;全反式视黄醛;解毒途径;视网膜色素上皮细胞;氧化应激

目的:揭示S2-S3 loop的钙离子结合位点对M2型瞬时受体电位通道(TRPM2)门控过程的影响.
创新点:首次探究了人类TRPM2通道(hTRPM2)和海葵TRPM2通道(nvTRPM2)S2-S3 loop的钙离子结合位点内四个氨基酸残基不同突变对通道激活及失活过程的影响,明确了钙离子结合位点对通道门控的作用.
方法:运用分子突变和电生理检测的方法,系统探究关键位点不同突变对hTRPM2和nvTRPM2激活及失活过程的影响,并采用生物素化及免疫印迹的方法,检测突变对通道表达上膜的影响.
结论:(1)钙离子不能单独激活nvTRPM2通道;(2)hTRPM2和nvTRPM2的四个关键氨基酸对钙离子依赖的门控调节作用类似;(3)在钙离子结合位点的四个关键氨基酸中,两个电负性氨基酸影响通道激活门控,两个电中性氨基酸影响通道失活门控.

关键词组：M2型瞬时受体电位通道(TRPM2);钙离子结合位点;S2-S3 loop;通道激活;通道失活

目的:运用核糖体技术激活恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis L10中的隐性基因簇,进一步研究突变菌株的次级代谢产物并初步探索其对应的生物合成基因簇激活机制.
创新点:首次分离得到了蒽塔恰霉素,并初步探索了RpoB突变株中蒽塔恰霉素生物合成基因簇的激活机制.
方法:采用核糖体工程技术,对S.chattanoogensis L10的RpsL和RpoB的高度保守区域定点突变,使用高效液相色谱法(HPLC)检测突变株的代谢产物.运用一维和二维核磁共振(1D NMR、 2D NMR)解析L10/RpoB (H437Y)的次级代谢产物蒽塔恰霉素的化学结构,通过铁离子还原法(FRAP)和ABTS自由基清除等实验研究其抗氧化活性.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和凝胶电泳迁移率分析(EMSA)探索蒽塔恰霉素生物合成基因簇的激活机制.
结论:L10/RpoB (H437Y)中蒽塔恰霉素的生物合成基因簇被激活.qRT-PCR和EMSA结果表明:RNA聚合酶β亚基结构改变,可能影响全局性调控基因的转录水平,并激活蒽塔恰霉素生物合成基因簇.

关键词组：链霉菌;隐性基因簇;定点突变;次级代谢产物

目的:克隆双头菌WH-1环氧乙烷二酸水解酶(ORCH)的基因并研究其酶学性质.
创新点:首次获得双头菌ORCH的基因,且该酶催化效率高,热稳定性好.
方法:柱层析纯化ORCH后,进行酶学性质研究;通过蛋白末端测序和PCR获得其基因序列;通过二级结构预测和多序列比对进行ORCH序列分析.
结论:来源于双头菌WH-1的ORCH是迄今报道的催化效率和热稳定性最好的ORCH,为L(+)-2,3-二羟基丁二酸的生产提供了新的催化剂.

关键词组：环氧乙烷二酸水解酶;L(+)-2,3-二羟基丁二酸;酶学性质;克隆

目的:研究新型溶瘤腺病毒GP73-SphK1sR-Ad5对肝癌细胞生长的抑制作用.
创新点:GP73-SphK1sR-Ad5是一种新型的溶瘤腺病毒,可以特异及有效地抑制肝癌细胞生长,为肝癌的临床治疗提供新思路.
方法:通过整合高尔基体蛋白73(GP73)及鞘氨基醇激酶1(SphK1)构建了GP73-SphK1sR-Ad5腺病毒,进而转染肝癌Huh7细胞及正常HL7702肝细胞.通过实时定量PCR和蛋白印记实验检测SphK1和E1A基因的表达;通过四氮唑盐比色分析法(MTT法)检测细胞活力;通过流式细胞术检测细胞凋亡率.构建Huh7异种移植小鼠模型,并注射GP73-SphK1sR-Ad5腺病毒.20天后,记录小鼠肿瘤体积和重量,以及存活时间.用苏木精-伊红(HE)染色法和透射电镜(TEM)观察肿瘤组织的病理变化.
结果:GP73-SphK1sR-Ad5转染显著上调了Huh7细胞中E1A的表达,下调了SphK1的表达,降低了细胞活性,并提高了凋亡率,然而对HL7702细胞无明显影响.Huh7异种移植小鼠模型内注射GP73-SphK1sR-Ad5显著降低了肿瘤的体积和重量,延长了小鼠的存活时间,并降低了肿瘤组织中的肿瘤浸润面积、血管密度及核变形和染色质浓缩的细胞数.
结论:新型溶瘤腺病毒GP73-SphK1sR-Ad5可以特异和有效地抑制肝癌进展.

关键词组：肝癌;溶瘤腺病毒;高尔基体蛋白73(GP73);鞘氨基醇激酶1(SphK1)

概要:为准确定位内窥镜视频中的人造物,帮助医生提升诊断准确率,引入深度神经网络检测与分割模型,采用特征金字塔与级联R-CNN相互结合的框架,并使用PSPNet结合分类器链的思想,从而解决分割及数据匮乏问题,有效提升性能,并在EAD 2019数据集上取得领先的性能.

关键词组：内窥镜;检测与分割;多类别人造物;级联R-CNN;PSPNet

目的:明确支原体污染对HEK-293细胞质粒DNA转染效率的影响,并从支原体对细胞精氨酸代谢的角度探究其机制.
创新点:支原体是细胞培养中的常见污染源.HEK-293是目前常用的生产蛋白、包装病毒的常用细胞系.然而,目前支原体污染对于质粒DNA转染效率的影响未见报道.本研究首次报道支原体污染对HEK-293细胞质粒DNA转染效率的影响,并揭示其机理.
方法:采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定HEK-293细胞中的支原体污染情况以及支原体抗生素Plasmocin对支原体污染的清除效果.通过聚乙烯亚胺(PEI)方法对支原体污染的HEK-293细胞及支原体清除后的HEK-293细胞转染质粒,比较转染效率差异.通过高效液相色谱法(HPLC)分析支原体污染的和支原体清除后的HEK-293细胞的细胞裂解产物和细胞上清中的L-精氨酸、瓜氨酸含量变化.在支原体污染的HEK-293细胞中补充L-精氨酸,观察质粒转染效率的改变情况.
结论:支原体污染能大大降低HEK-293细胞中质粒DNA的转染效率,且其原因与支原体能耗竭细胞中的L-精氨酸有关.

关键词组：支原体;质粒;转染效率;精氨酸;HEK-293细胞